پایان نامه درمورد سانتریفیوژ و قرارداد

شکل4-3) قارچ B.bassiana(سمت چپ)، قارچ M.anisopilae (سمت راست)
-3-2-3)تهیه سوسپانسیون هاگ
تعیین غلظت سوسپانسیون توسط لام هموسیتومتر(لام گلبول شمار) ساخت شرکت نیوبائر ومیکروسکوپ متباین یا فازکنتراست413 B*ساخت شرکت الیمپوس انجام میگرفت .جهت انجام این کاردریک محیط استریل 100میکرولیترازسوسپانسیون اصلی توسط میکروپیپت یاسمپلربرداشته شده و با آب مقطر به میزانn10برابر رقیق شده و آنگاه10میکرولیترازاین محلول رقیق شده برروی سطح موردشمارش روی لام هماسیتومترریخته شد وروی آن یک لامل تمیزقرارمیگرفت .پس ازگذشت 5دقیقه که حرکت کنیدیهاکم شدتوسط میکروسکوپ فازکنتراست بابزرگنمایی 40 تعدادکنیدی ها شمارش میشد.برای شمارش تعداد کنیدی ها5مربع بزرگ موجوددرقطرموردشمارش قرارمیگرفت.این کاربرای هرنمونه سه بارانجام گرفته ومیانگین شمارش هامحاسبه میگردید.درپایان میانگین مجموع کنیدیهای 5مربع درفرمول زیر(3-1)جایگزین شده وغلظت کنیدی به ازای میلی لیترسوسپانسیون اصلی محاسبه میگردید.
(فرمول3-1)
درفرمول فوق X میانگین مجموع کنیدی های شمارش شده در5مربع در3 تکرار وYمجموع کنیدی های موجوددریک میلی لیترسوسپانسیون اصلی فارچ می باشد.درصورت رقیق کردن سوسپانسیون، جهت تعیین غلظت بدست آمدهغلظت قبلی درفاکتورترقیق(D=10n)ضرب میگردد(Erwin,1985). عدد5 نشانگرتعدادمربعات بزرگ مورد شمارش درقطرلام وعدد16بیانگرتعدادمربعات کوچک موجوددرهرمربع بزرگ می باشد. مقدار 2*10-7 نیز مقدار ثابت Kاست که باتوجه به ویژگی لام هموسیتومترتوسط سازنده محاسبه گردیده ودرفرمول جایگزین شده است.
Widget not in any sidebars

درصورتی که سوسپانسیون پایه ای که تعیین غلظت می شد دارای غلظت کافی بودمی توان ازطریق رقیق کردن متوالی وبا استفاده ازفرمول زیر(فرمول 3-2)غلظت های پایین تررابدست آورد.
(فرمول3-2) N1V1=N2V2
ولی درصورتی که سوسپانسیون پایه تهیه شده رقیق باشدمی توان بااستفاده ازسانتریفیوژ کردن ان راتغلیظ کرد.برای انکه عمل تغلیظ انجام شود محلول در14000دوردردقیقه(rpm) به مدت 10دقیقه سانتریفیوزمیگردید.انجام عمل تغلیظ تارسیدن به غلظت مورد نیاز ادامه پیدامیکرد.
هاگ های تشکیل شده درمحیط کشت بوسیله یک سوزن سرنیزه ای خراشیده شده درشیشه مک کارتی دارای 1/0±1سی سی آب مقطر قرارداده شدند. سپس برای 3-2دقیقه بوسیله vortex کاملامخلوط گردیدند. سوسپانسیون پس ازعبورازپارچه ململ 4لایه سترون درشیشه مک کارتی جمع اوری شده وبه شدت تکان داده شدبطوریکه درنهایت یک مخلوط یکنواخت بدست امد. سوسپاسیون مربوط به قارچB.bassiana به رنگ سفیدشیری وقارچ M.anisopliaeبه رنگ سبز زیتونی میباشد؛ سوسپانسیونیکه به این صورت تهیه میشد اماده تعیین غلظت بود.

شکل 5-3) نحوه تقسیم بندی یک لام هموسیتو متر

شکل 6-3 ) نحوه استفاده از لام هموسیتومتر

شکل 7-3) نحوه تهیه سوسپانسیون قارچ B.bassiana(سمت راست)، قارچ M.anisopilae(سمت چپ)
3-2-4) آزمایش زنده مانی
قبل ازاستفاده ازسوسپانسیون موردنظرازمایش زنده مانی کنیدیوم ها انجام گرفت. 100µl از سوسپانسیون رقیق به صورت قطره قطره در سطح تشتک آب آگار ریخته و پتری بصورت دورانی حرکت داده شد تا سوسپانسیون کاملا پخش شد. سپس اطراف تشتک را با پارافیلم پوشانده و در انکوباتور25 درجه سانتی گراد به مدت 18-16 ساعت قرارداده شد. زیر میکروسکوپ در 3 تکرار 100 کنیدی بطور تصادفی شمارش شد و بافرمول زیر (فرمول3-3) درصد قابلیت زیست آنها محاسبه شد.
فرمول3-3