مقاله درمورد سرعت تولید و استاندارد

دانلود پایان نامه
  • آگار 20 گرم
    آب مقطر 1000 میلی لیتر
    این محیط برای تحریک قارچها به اسپوردهی، تولید میکروکنیدیوم، تولید کلامیدوسپور و نیز مشاهده فیالید بسیار مناسب است.
    3-3- روشهای جداسازی (isolation) قارچها:
    3-3-1- استفاده از محیط کشت PDAی اسیدی شده
    برای کشت اندامهای گیاهی روی این محیط ، ابتدا ساقههای آلوده به مدت 5 دقیقه در جریان شیر آب (جهت برطرف کردن گرد و خاک در ساپروفیتهای سطحی) قرار داده شده و از محل بافت سالم و آلوده و یا مغز ساقه آلوده قطعاتی به قطر چند میلیمتر تا 1 سانتیمتر بریده شده و سپس با محلول1٪ هیپوکلریت سدیم NaClO به مدت 4-2 دقیقه ضدعفونی سطحی شد. قطعات مذکور به تعداد 3 بار و هر بار به مدت 4-2 دقیقه با آب مقطر استریل شسته شد و پس از خشک کردن توسط کاغذ صافی استریل، با ذکر مشخصات، 4-3 قطعه بداخل پتری PDAی اسیدی شده منتقل شد. پس از 2-1 روز از حاشیه کلنی رشد کرده، یک تکه (Plug) به پتری دیگر انتقال داده و از این محیط برای مراحل بعدی که خالص سازی و شناسایی قارچ است ، استفاده گردید.
    3-4- روش خالصسازی جدایهها:
    خالص کردن (purification) قارچها بوسیله روش تک اسپور (single sporing)
    برای تک اسپورکردن جدایهها از WA %2 استفاده شد. برای این منظور به هر تشتک 9 سانتیمتری حدود 10 میلیمتر محیط کشت ریخته تا لایه نازکی از WA در تشتک تشکیل شود. سپس داخل لولههای آزمایش (با حجم تقریبی 10میلیمتر) که محتوی 2میلی متر آب مقطر استریل بود یک مقدار کم مایه تلقیح (Inoculum) اضافه کرده تا سوسپانسیونی از اسپور تشکیل شود.
    یک لوپ از سوسپانسیون را برداشته و روی لام قرار داده و با بزرگنمایی x10 میکروسکوپ مشاهده گردید. زمانی که تعداد اسپورها در یک زمینه x10 میکروسکوپ به 10 عدد میرسید برای تک اسپور کردن مناسب بود و در صورتیکه تعداد اسپورها بیشتر بود آن را رقیق کرده و اگر تعداد اسپورها کمتر بود، برای بدست آوردن غلظت مناسب، باز هم مایه قارچ اضافه شد. پس از همگن کردن سوسپانسیون اسپور، یک لوپ از آن را برداشته و در خطوطی موازی روی سطح WA مخطط شد. پس از 16-8 ساعت از نگهداری تشتکها در دمای 25 درجه سانتیگراد، اسپورها جوانه زده و زیر میکروسکوپ قابل رؤیت شدند. برای مشاهده اسپورهای جوانه زده ، تشتکها به صورت وارونه مورد بررسی قرار گرفتند و با استفاده از یک ماژیک نوک باریک یا روان نویس دور اسپورهای جوانه زدهای که از سایر اسپورها فاصله کافی داشتند خط کشیده شد. سپس بوسیله یک اسکالپل استریل قطعه علامت زده شده، برداشته شد و به تشتکهای حاوی PDA منتقل گردید و در دمای 25 درجه سانتیگراد نگهداری شد. از هر پتری مخطط شده دو یا سه اسپور ، به عنوان تکرارهای هر جدایه ، برداشته و به PDA منتقل گردید (Nelson et al., 1983).
    3-5- روش وادارسازی جدایه ها به تولید اسپور (sporulation)
    بعضی قارچها برای اسپورزایی نیاز به زمان طولانی دارند. قارچهایی مثل فوزاریوم اگر تحت شرایط نوری خاصی قرار گیرند، با سرعت بیشتر و تعداد بیشتری اسپور داده و اسپورهای تیپیک بهتری تولید می کنند.
    برای سرعت بخشیدن به شناسایی قارچها و استاندارد کردن روش ، از محیط کشت ضعیف و شرایط خاص نوری و دمایی استفاده شد. بدین منظور از محیط کشت CLA که یک محیط کشت ضعیف و نیمه طبیعی است، استفاده شد . پس از کشت قارچ روی محیط CLA ، محیط مذکور به مدت 24 ساعت در انکوباتور 25درجه سانتیگراد قرار گرفت و سپس به اتاقک NUV (Near Ultra Violet) (تصویر3-1)

      دانلود تحقیق در مورد هوش هیجانی و کاربرد آن و مدیریت فرهنگ سازمانی

    عکس 3-1- دستگاه NUV جهت تسریع در اسپورزایی
    با فتوپریود 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی و در 25درجه سانتیگراد منتقل گردید(Nelson et al., 1983) . 6-5 روز پس از کشت، قارچها اقدام به اسپورزایی کردند، در این حال بهترین زمان برای دیدن فیالیدها و مخصوصاً پلی فیالید بود. از روز دهم به بعد ماکروکنیدی های زیادی روی CLA تشکیل شدند.
    3-6- روش وادارسازی جدایه ها به تولید کلامیدوسپور
    معمولاً در قارچ های فوزاریوم آن گونه هایی که توانایی تولید کلامیدوسپور را دارند، قادرند روی محیط CIA هم کلامیدوسپور تولید کنند ولی سرعت تولید آن بسته به گونه و جدایه ی قارچ متفاوت است. به عنوان مثال جدایه های F.equiseti در سطح CIA بعد از دو هفته به میزان کافی کلامیدوسپور تولید کردند، اما جدایه های F.solani و F.oxysporum نیاز به زمان بیشتری برای تولید کلامیدوسپور داشته اند. بمنظور تسریع در تولید کلامیدوسپور از روشی که نلسون و همکاران (Nelson et al., 1983)ارائه کردند استفاده گردید.
    بدین طریق که یک تکه از محیط کشت PDA حاوی میسیلیوم قارچ انتخاب و در لوله های آزمایش کوچک حاوی آب مقطر استریل قرار گرفت و در شرایط 5-4 درجه سانتیگراد نگهداری شد. با این روش بعد از هفت روز بیشتر جدایه ها کلامیدوسپور تولید کردند.
    3-7- روش نگهداری کشت خالص قارچ ها
    بعد از خالص سازی قارچ ها لازم بود هر جدایه برای استفاده های بعدی و جلوگیری از آلوده شدن به کنه ها و دیگر قارچ ها به طریق مناسبی نگهداری شود. برای این منظور از محیط کشت مورب WA و CLA و یا PDA استفاده گردید. برای تهیه ی CLA در لوله، هنگامی که WA در لوله ریخته شده بود و اتوکلاو شده بود، در زیر هود و شرایط استریل به هر لوله 5-4 تکه برگ میخک استریل اضافه شد و دوباره درب آن گذاشته شد و روی سطح شیب دار قرار گرفت، محیط کشت WA و CLA بدلیل فقیر بودن مانع از موتاسیون شده و بیماری زایی قارچ نیز نسبت به PDA کمتر کاهش پیدا می کند و ازین نظر بر محیط کشت PDA ارجحیت دارد.
    3-8- روش تشخیص جدایه ها (Procedur for identification)
    3-8-1- روش تشخیص قارچهای مربوط به جنس فوزاریوم
    تشخیص گونههای مربوط به جنس فوزاریوم براساس ویژگیهای ماکروسکوپی و صفات کشتی (cultural characteristics) مثل نحوهی رشد کلنی ، رنگ کلنی از پشت و روی پتری، سرعت رشد قارچ در شرایط استاندارد، وجود و یا عدم وجود میسلیومهای هوایی، رنگ میسلیومهای هوایی ، رنگ منتشر شده از قارچ بداخل آگار، رنگ توده اسپورها (اسپورودوخیومها) و ویژگی های میکروسکوپی قارچ روی محیط CLA در شرایط استاندارد، مثل اندازه و شکل ماکروکنیدیهای تولید شده از اسپورودوخیوم، شکل سلول انتهایی (Apical cell) و سلول پایه (basal cell) ماکروکنیدی ، وجود و یا فقدان میکروکنیدی و شکل و نحوه تولید آن (در زنجیر یا سرهای دروغین(false heads) )، نوع فیالید (پلی یا مونوفیالید، منشعب یا غیرمنشعب) و وجود یا فقدان کلامیدوسپور و چگونگی تولید آن(منفرد (single)، جفتی(pairs) ،زنجیری (chain) ،یا خوشه ای (clump))، اندازه ماکروکنیدیها و میکروکنیدیها با استفاده از کلیدهای معتبر مانند (Booth, 1971; Gerlach & Nirenberg, 1982; Nelson et al., 1983; Burgess et al., 1994; Leslie & Summerell, 2006; Darvishnia et al., 2007) ) و با بکارگیری محیط کشتهای مختلف صورت پذیرفت. از محیط PDA برای تعیین شکل و رنگ کلنی، نحوه رشد و وجود و عدم وجود ریسههای هوایی استفاده شد.
    3-9- روشهای تهیه مایه تلقیح (inoculums) جهت آزمون بیماریزایی قارچهای فوزاریوم
    3-9-1- روش تهیه مایه تلقیح روی بذر جو

    این نوشته در مقالات و پایان نامه ها ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.