مقاله درباره بیوتکنولوژی و تحلیل داده

9- محلول رنگ زدا: که همان محلول متانول- استیک اسید تولید شده است.
Widget not in any sidebars

2-8-2- اجرای الکتروفورز
برای انجام الکتروفورز پروتئین به روش SDS-PAGE نیاز به دو ژل جدا کننده و متراکم کننده و به عبارت دیگر ژل پائین و ژل بالا است که در این روش از ژل متراکم کننده 5 درصد و ژل جداکننده 12 درصد استفاده شد و این دو ژل بر روی هم و در داخل یک قالب ریخته شدند. قالب دربرگیرنده ژل شامل دو صفحه شیشهای و نوارهای فضاساز بوده که در اطراف و بین دو صفحه شیشهای قرار گرفته و ضخامت ژل را بوجود میآورد. صفحات شیشهای و نوارها بر روی پایه نگهدارنده نصب شدند و برای جلوگیری از نشت ژل از فضاهای بین شیشه و نوار، از محلول یک درصد آگاروز ( حل شدن 1 گرم آگاروز در 100 میلی لیتر آب مقطر) جهت آب بندی استفاده شد. این محلول به صورت داغ استفاده شد و به محض سرد شدن به صورت ژل در میآمد.
الف- تهیه ژل پائین
برای تهیه 20 میلی لیتر ژل جدا کننده 12 درصد، مقادیر 8 میلی لیتر محلول 30 درصد اکریل آمید و 5 میلی لیتر بافر 5/1 مولار تریس (8/8=pH) به 6/6 میلی لیتر آب مقطر اضافه شد. سپس 2/0 میلی لیتر از محلول 10 درصد SDS و 2/0 میلی لیتر از محلول 10 درصد تازه پرسولفات آمونیوم به آن اضافه گردید. همچنین 008/0 میلی لیتر تمد به محلول اضافه شد و پس از هم زدن سریعأ به داخل قالب ریخته شد. ارتفاع آن به 8-10 سانتی متر رسید و برای صاف شدن سطح ژل، بقیه فضای قالب با آب مقطر پر شد. این کار بسیار سریع انجام شد، زیرا در غیر اینصورت سطح ژل فرورفتگی یافته و بسیار ناصاف میشود. بعد از گذشت 60 دقیقه ژل پائین بسته شده و به عبارت دیگر عمل پلیمریزه شدن انجام میگیرد. پس از گذشت این مدت، آب مقطر سطح ژل خالی شده و بوسیله کاغذ صافی رطوبت اضافی موجود در فضای خالی قالب خشک شده و آماده ریختن ژل بالا گردید.
ب- تهیه ژل بالا
برای تهیه 5 میلی لیتر ژل متراکم کننده 5 درصد، 83/0 میلی لیتر از محلول پایه اکریل آمید ( محلول شماره 1) و 83/0 میلی لیتر از بافر یک مولار تریس (8/6=pH) به همراه 4/3 میلی لیتر آب مقطر به خوبی مخلوط شد. سپس 05/0 میلی لیتر محلول 10 درصد SDS و پس از آن 05/0 میلی لیتر محلول 10 درصد پرسولفات آمونیوم و 005/0 میلی لیتر تمد به محلول قبلی اضافه شد و محلول حاصله در داخل قالب و بر روی ژل پائین ریخته شد و سریعأ شانه جهت ایجاد چاهک در ژل بالا، به داخل ژل بالا وارد شد. برای جلوگیری از حبس شدن حباب هوا در زیر دندانههای شانه، دندانههای شانه یکی یکی وارد زل بالا شده و سپس در یک سطح صاف شدند. بعد از گذشت 30 دقیقه ژل بالا نیز پلیمریزه شد که با بیرون کشیدن شانه، ژل آماده تزریق نمونه گردید.
ج- آماده سازی نمونههای گلوتن جهت تزریق در چاهک
از هر یک از نمونههای گلوتن، مقداری معین حاوی یک میلی گرم پروتئین، وزن شد و در لوله 5/1 میلی لیتری ریخته شد. سپس 170 میکرولیتر از بافر بارگذار به هر یک از لولهها اضافه شد و پس از بستن در آن، به کمک دستگاه ورتکس کاملأ مخلوط گردید. نمونهها به مدت 5 دقیقه در آب جوش قرار گرفت سپس در دمای اتاق سرد شد.
د- راه اندازی دستگاه الکتروفورز
با بیرون کشیدن شانه از داخل ژل، چاهکهای حاصله با بافر حرکتی رقیق شده، شسته شدند و سپس قالب ژل از پایه جدا شد و نوار پائینی قالب نیز بیرون کشیده شده و بر دستگاه الکتروفورز سوار گردید. تانکهای بالا و پائین دستگاه با محلول رانینگ بافر پر شد. جهت جلوگیری از هر گونه نشت محلول رانینگ بافر از تانک بالا به پایین و تنها وجود ارتباط بین این دو تانک از طریق ژل، محل تماس قالب ژل با دستگاه الکتروفورز از طریق روغن پارافین و یا ژل آگاروز آببندی شد.
ه- تزریق نمونه به داخل چاهک
با سوار شدن دستگاه، به کمک میکروپیپت مدرج، به میزان 10 میکرولیتر از محلول حاوی پروتئین نمونهها به داخل هر چاهک تزریق شد. همچنین در یک چاهک پروتئین با وزن مولکولی استاندارد ( مارکر پروتئین) تزریق شد. در زمان ورود میکروپیپت به داخل چاهک زاویه تزریق 45 درجه بود تا محلول پروتئین از چاهک خارج نشده و در ته آن قرار گیرد.
و- روشن کردن دستگاه
پس از تزریق نمونهها، الکترود بالا به قطب منفی و الکترود پائین به قطب مثبت متصل شد و پس از پر کردن مخزن سیستم خنک کننده با آب، دستگاه روشن شد و شدت جریان بر روی 25 میلی آمپر تنظیم گردید. پس از گذشت 3-4 ساعت نمونهها به انتهای ژل رسیدند و پس از خروج نمونهها از انتهای ژل، دستگاه خاموش شده و قالب ژل از داخی دستگاه خارج گردید. با حذف ژل بالا و بریدن آن، ژل پائین علامت گذاری شده و به داخل محلول رنگی منتقل شد و به مدت 24 ساعت بر روی دستگاه همزن با دور آرام قرار گرفت با گذشت این مدت محلول رنگ خالی شده و ژل رنگ شده پس از شستشو با آب مقطر، به داخل محلول رنگ زدا منتقل گردید و به مدت 10-6 ساعت در این محلول باقی ماند. پس از این مدت رنگهای زمینه از بین رفته و فقط باندها مشخص شدند. پس از شفاف شدن ژل، از آن عکس برداری شد.
لازم به ذکر است که این آزمون در گروه بیوتکنولوژی دانشگاه صنعتی اصفهان انجام گرفت.
2-9- روش آماری تحلیل داده‌ها
در این تحقیق، تجزیه تحلیل نتایج مطابق آزمون فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی انجام شد و برای مقایسه میانگینها و بررسی تفاوت معنادار بین آنها از آزمون LSD در سطح احتمال 5 درصد استفاده گردید. تجزیه و تحلیل دادهها با استفاده از نرم افزار SAS و رسم نمودارها با نرم افزار Excel انجام گرفت.

Share this post

Post navigation

You might be interested in...