مقاله با موضوع بهینه سازی و نرم افزار

3-5. طراحی پرایمر و پروب و بررسی کیفیت آنها :
پرایمرها و پروب های اختصاصی برای ژن های مورد نظر به منظور بررسی بیان در سطح RNA در نرم افزار(Version 3.05) Gene runner طراحی شد. در طراحی پروب هایTaqman، انتخاب رنگ مناسب گزارشگر و خاموش کننده که برای نشان دار کردن پروب استفاده می شود مهم است که می بایست توسط دستگاه Real-Time PCR مورد استفاده در آزمایشگاه نیز پشتیبانی شود. برای اجتناب از اتصال پرایمر و پروب های طراحی شده به سایر توالی های مشابه با توالی های ژن مورد نظر از BLAST که بر روی اینترنت (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) در دسترس هستند استفاده شد. در این مطالعه از خاموش کننده(Quencher) TAMRA در انتهای 3ʹ و از گزارشگر FAM در انتهای 5ʹ استفاده شده است.
Widget not in any sidebars

پرایمرهای طراحی شده پس ازخریداری از شرکت با اضافه کردن آب مقطر استریل به مقدار تعیین شده از طرف شرکت، محلولی از پرایمرها با غلظت mol) pmol/μlμ( 100 تهیه گردید که به عنوان محلول ذخیره‌ای (stock ) در دمای 20- نگهداری شد. برای استفاده‌ کردن از این محلول، می‌بایست آن را تا 10 برابر رقیق‌تر کنیم. برای این کار μl10 از محلول ذخیره در یک میکروتیوب جدید ریخته وμl 90 آب مقطر استریل به آن اضافه گردید. بدین ترتیب محلول قابل استفاده (working ) با غلظت mol) pmol/μlμ(10 به دست آمد که در واکنش از آن استفاده گردید.
با NCBI BLAST اختصاصیت پرایمرها برای چسبیدن به ژنوم انسانی مورد بررسی قرار گرفت تا از منحصر به فرد بودن محل جفت شدن پرایمرها اطمینان حاصل شود. نتایج جستجو در ژنوم انسان، نشان داد که کلیه پرایمرها محل اتصال منحصر به فردی را دارا می‌باشند.
3-5-1. غلظت بهینه پرایمر
ابتدا از پرایمرها یک محلول با غلظت 10 تهیه شد. جهت یافتن غلظت بهینه پرایمر ابتدا برای هر یک از آنها واکنش Real-Time PCR با استفاده از 7.5 میکرولیتر SYBRGreenMaster Mix (2X) از شرکت ®Primer Design و با غلظت پرایمر 2/0، 3/0، 4/0، 5/0 میکرومولار در حجم کلی 15 میکرو لیتر انجام شد. غلظتی که در آن کمترین سیکل آستانه (CT) و بیشترین میزان فلورسانت مشاهده شد به عنوان بهترین غلظت پرایمر مورد استفاده قرار گرفت.
3-5-2. آنالیز منحنی ذوب:
به منظور اطمینان از عدم تکثیر غیر اختصاصی و پرایمر دایمر، پس از اتمام واکنش منحنی ذوب هر یک از نمونه های تکثیر شده توسط دستگاه رسم شد.
3-5-3. غلظت بهینه پروب:
جهت یافتن غلظت بهینه پروب واکنش Real-Time PCR با بهترین غلظت پرایمر و سه غلظت 2/0، 3/0 و 4/0 میکرومولار پروب در حجم کلی 15میکرو لیتر انجام شد. انتخاب غلظت مناسب بر اساس چرخه آستانه کمتر و میزان فلورسانت بیشتر تعیین می شود.
3-5-4. تهیه سریال رقت به منظور بررسی کارائی پرایمرها :
از انجایی که نزدیک بودن کارایی پرایمرها در جواب نهایی بسیار مهم است می بایست کارایی پرایمر های مورد استفاده سنجیده شود که این امر بصورت ذیل انجام گردید:
ابتدا از cDNA مربوط به چندین نمونه Testis موجود یک Gene Pool بدست آمد. سپس با استفاده از OD نمونه نهایی 5 رقت 4/1ساخته شد. لازم بذکر است که بررسی کارایی پرایمر برای هر کدام از ژن های مورد مطالعه در این تحقیق انجام شد. تمام واکنش ها در این مرحله بصورت Duplicate انجام شد. منحنی استاندارد رسم شده توسط خود دستگاه شامل اطلاعاتی در مورد کارائی، شیب نمودار و رگرسیونR2 می باشد. کارایی کمتر از 90% می بایست از نظر اندازه آمپلیکون، ساختارهای ثانوی و طراحی پرایمر دوباره چک شده و بهینه سازی شود.
3-6-. انجام تکنیک Real-Time PCR بر روی نمونه های مورد مطالعه :
واکنش Q-RT-PCR با استفاده از Master Mix 2x از شرکت ®Primer Design در واکنش‌های 15 میکرولیتری و با تکرارهای سه تایی انجام شد. چرخه های دمایی به صورت 10دقیقه 95 و 40 چرخه 95 به مدت 15 ثانیه و 60 به مدت 30 ثانیه بود. اندازه‌گیری میزان فلورسانت توسط دستگاه Applied Biosystems 7500و آنالیز اولیه داده‌ها توسط نرم‌افزار 7500 software system ver.2.0 انجام شد.
پروتکل استفاده از Master Mix شرکت Primer Design® در دستگاه Applied Biosystems 7500 در جدول3-2 و برنامه دمایی در جدول 3-3 ذکر شده است.
جدول3-2: دستورالعمل انجام واکنش بر اساس کیت سازنده
Volume Reagent
7.5μl Precision Mastermix(with low ROX)
× μl Forward Primer (6 pmol)
× μl Reverse Primer (6 pmol)
× μl TaqMan® probe (3 pmol)
× μl Template(25ng)
× μl RNase/DNase free water(up to final volume)
15 μl Final volume
برنامه دمایی به دستگاه Real-Time بصورت زیر داده شد :

Share this post

Post navigation

You might be interested in...