دانلود پایان نامه درجه حرارت و نرم افزار


Widget not in any sidebars

3-1) حیوانات
مدل آزمایشگاهی مورد استفاده در کلیه آزمایش‌ها، حلزون باغی (Caucasotachea atrolabiata, krynicki, 1833) بود (شکل 3-1). نمونه بالغ حلزون باغی، دارای صدف بزرگی با قطر تقریبی 3 سانتیمتر راست گرد، فشرده (طول کمتر از عرض) و دارای 4 تا 5 پیچ در طول صدف می‌باشند. صدف در رنگ‌های مختلف و معمولا به رنگ قهوهای تیره یا شاه بلوطی با نوارهای زرد رنگ دیده می‌شود. نمونه‌ها در شرایط مناسب از لحاظ درجه حرارت مناسب، نور و در محیط مرطوب نگهداری و با هویج، خیار و کاهو تغذیه میشدند.
شکل 3-1. حلزون باغی(Caucasotachea atrolabiata)
3-2) تشریح و آماده سازی گانگلیون عصبی جهت ثبت
آزمایش‌ها بر روی نورون‌های مجموعه گانگلیونی تحت مری انجام می‌گرفت (شکل 3-2). قبل از انجام آزمایش، بمنظور ایجاد شرایط فیزیولوژیک یکسان و حصول اطمینان از فعال بودن جانور، آن‌ها را درون ظرف آب قرار داده و پس از فعال شدن ابتدا صدف جانور بوسیله انبر استخوان شکن برداشته شده و سپس به کمک سوزن سر و پای حلزون بدون صدف روی چوب پنبه ثابت می‌شد. با ایجاد شکافی طولی در ناحیه گردن جانور، حلقه گانگلیونی دور مری شناسایی و از بدن خارج شده و به داخل محفظه ثبت با بستر سیلگارد و حاوی رینگر نرمال حلزون منتقل و سپس با سوزن حشره در این محفظه تثبیت می‌شد. نورون‌ها در این مجموعه گانگلیونی بوسیله دو لایه بافت پیوندی احاطه شده‌اند. بخش پشتی گانگلیون دارای اعصاب کمتری بوده و با برداشتن لایههای پیوندی در این ناحیه، توسط پنس‌های بسیار ظریف در زیر استریومیکروسکوپ، نورون‌ها آشکار می‌شدند.
شکل 3-2. گانگلیون تحت مری تثبیت شده در محفظه ثبت
3-3) محلولها و داروها
محلول رینگر نرمال حلزون شامل (بر حسب میلی مولار):
NaCl (80)، (10) CaCl2، MgCl2 (5)، KCl (4)، HEPES (5) و Glocuse (10)بود (Taylor, 1987) و PH آن به کمک دستگاه PH متر و با استفاده از Trisma base در حد 6/7-4/7 تنظیم می‌گردید. همچنین محلول رینگر فاقد سدیم نیز با جایگزین کردن NaCl به میزان معادل از Trise-HCl تهیه میشد و PH آن مشابه قبل تنظیم میگردید.
کامفر (Sigma, USA) در یخچال نگهداری می‌شد. قبل از انجام آزمایش‌ها غلظت‌های مناسب آن تهیه و در حین انجام آزمایش دوزهای مورد نظر به محفظه ثبت سلولی افزوده می‌شد. با توجه به حلالیت پایین کامفر در آب ازDMSO بعنوان حلال اولیه محلول ذخیره کامفر استفاده می‌شد.
سایر داروها شامل نیکل کلرید (مهارکننده غیراختصاصی کانال‌های کلسیمی) ،کلریترین (مهارکننده PKC ) و H89 (مهارکننده PKA)، سدیم نیترو پروساید(آزادکننده نیتریکاکسید) نیز در یخچال نگهداری و مورد استفاده قرار گرفت.
3-4) ثبت داخل سلولی
پتانسیل‌های عمل خودبخودی و برانگیخته در شرایط کنترل و متعاقب تیمارهای مختلف با روش تثبیت جریان با استفاده از آمپلی فایر (npi, Germany) SEC-10LX ثبت گردید. میکروالکترودهای مورد استفاده از میکروپیپت‌های دیواره نازک از جنس بروسیلیکات (USA) و با کمک یک میکروالکترود پولر افقی (Sutter Instrument, USA) تهیه می‌شد. الکترودها با محلول KCl سه مولار پر شده و نمونه‌های بدون نشت که 5-1 مگا اهم مقاومت داشتند جهت ثبت مورد استفاده قرار می‌گرفتند. یک سیم نقره با روکش کلرید نقره محلول داخل میکروالکترود شیشهای را به ورودی پرهآمپلی فایر وصل می‌کرد. در تمام آزمایش‌ها از یک پل آگار بعنوان الکترود مرجع استفاده می‌شد که محلول محفظه ثبت را به پتانسیل صفر (زمین) وصل می‌کرد (شکل3-3). پس از ورود الکترود به نورون، ثبت پایه برای حدود پنج دقیقه به عمل می‌آمد و درصورتی که نورون دارای پتانسیل پایدار پایینتر از mV37- بود، ثبت پتانسیل‌های غشائی در وضعیت تثبیت جریان در شرایط کنترل و متعاقب تیمارهای مختلف به عمل می‌آمد. داده‌های ثبت شده توسط یک مبدل آنالوگ-دیجیتال HEKA, Germany)) رقمی شده و به کمک نرم افزار Patchmaster ذخیره می‌گردید و آنالیز دادهها با نرمافزار fitmaster انجام میشد.
شکل 3-3. نمایی از وسایل ثبت داخل سلولی. ولتاژ غشاء ثبت شده توسط میکروالکترود (A) بترتیب به آمپلی فایر، مبدل آنالوگ/ دیجیتال و دیجیتال/آنالوگ (B) و نهایتاٌ به کامپیوتر (C) منتقل می‌شود.
3-5) مراحل آزمایش
جهت بررسی و مطالعه فعالیت خودبخودی نورون‌ها در شرایط کنترل ابتدا به مدت 5 دقیقه ثبت پایه در رینگر نرمال بعمل می‌آمد و فرکانس و ویژگی‌های اسپایک‌های خودبخودی نورون‌ها ثبت می‌شد. سپس بمنظور بررسی اثر مستقیم کامفر بر فعالیت الکتریکی سلول و نقش احتمالی آن در تحریک‌پذیری نورونی، این ماده با غلظت ‌5/1 میلی مولار به محفظه ثبت داخل سلولی افزوده می‌شد و همانند شرایط کنترل فعالیت خودبخودی و برانگیخته مورد مطالعه قرار می‌گرفت.
بمنظور بررسی نقش کانال‌های کلسیمی در رابطه با عملکردکامفر، از مهارکننده‌ این کانال‌ نیکل کلرید (مهار کننده غیر اختصاصی کانال‌های کلسیمی) و به منظور بررسی نقش کانالهای سدیمی ثبت در محلول فاقد سدیم صورت گرفت همچنین برای بررسی نقش پروتئین کینازها از کلریترین (مهار کننده PKC )، H89 (مهار کننده PKA) استفاده شد.
3-6) پارامترهای الکتروفیزیولوژیک مورد مطالعه
پارامترهای الکتروفیزیولوژیک مورد بررسی در این مطالعه از قرار زیر می‌باشند:
پتانسیل استراحت غشاء (RMP)
آستانه پتانسیل عمل (Threshold)
فرکانس فعالیت الکتریکی خودبخودی

Share this post

Post navigation

You might be interested in...