دانلود پایان نامه با موضوع بیماری عروق کرونر قلب و بیماری عروق کرونر


Widget not in any sidebars

3-4)بررسی تغییرات متابولیکی در سلول های CHO DG44 تولید کننده t-PA 115
3-4-1)بررسی تغییرات متابولیکی در محیط ProCHO 5 115
3-4-2)تغییرات متابولیکی در محیط CD DG44 117
3-4-3) بررسی تغییرات متابولیکی در محیط BRC CD 118
3-5)بررسی تاثیر پپتون ها بر میزان بیان پروتئین نوترکیب 119
3-6)بررسی تاثیر استراتژی تغذیه با پپتون های گیاهی در بهینه سازی TGE 121
بحث و نتیجه گیری نهایی 129
منابع 133
اختصارات 136
Optimization of recombinant protein production in TGE system 137
Abstract 137
فصل اول
مقدمه
چکیده
بیماری عروق کرونر قلب یکی از شایع ترین بیماری ها در سطح جهان به خصوص کشور های صنعتی می باشد.
فعال‌کننده پلاسمینوژن بافتی (t-PA( Tissue Plasminogen Activator، یک پپتید طبیعی است که با اتصال به فیبرین موجود در لخته و تبدیل پلاسمینوژن به پلاسمین باعث شکسته شدن فیبرین، فیبرینوژن و سایر پروتئین‌های انعقادی شده و با رفع انسداد باعث به حداقل رساندن آسیب بافتی و در نهایت نجات بیمار می‌شود. پروتئین مورد بررسی در این مطالعه فرم کوتاه شده موتانت از داروی t-PA باخواص فارماکولوژیک بهینه می باشد که در میزبان بیانی CHO(Chinese Hamster Ovary) با هدف تغییرات پس ترجمه ای مناسب و مشابه فرم طبیعی بیان می شود.
بیان موقت پروتئین(Transient Gene Expression) TGE روش رایجی برای بیان پروتئین های نو ترکیب در بازه زمانی کوتاه و در مقیاس مناسب جهت انجام تست های پیش بالینی Preclinical)) می باشد.در این مطالعه از این روش و بهینه سازی آن برای تولید پروتئین نوترکیب t-PA استفاده شد و مقادیر بهینه شده برای میزان cell DNA106/µg2 وبرای عامل انتقال ژن Transfection reagent)) cell 106/µg5/1 و میزان سلول مورد استفاده 105×5 سلول معین گردید.همچنین با دیدگاه Scale-up در بیوپروسه و اثر استراتژی های تغذیه ای با عوامل پپتونی مختلف بر میزان بیان و رشد پروتئین و تغییر رفتار متابولیک آن بررسی گردید.به منظور بهینه سازی بیان فعال‌کننده پلاسمینوژن بافتی (t-PA)در سلول CHO در این فرایند از 6 پپتون با منشا گیاهی(Soy,Casein) مختلف استفاده گردید .آنالیز نتایج نشان داد که چگونگی تاثیر پپتون ها بر روی بیان ژن مورد نظر در سلول CHO در تعدادی از پپتون ها از الگوی خاصی تبعیت می کند.در برخی موارد اثر مثبت و در موارد خاصی تاثیر منفی داشته است , که احتمالا این تاثیرات ناشی از ماهیت ترکیب آمینو اسیدی پپتون های به کار رفته می باشد. همچنین استفاده از این ترکیبات پپتونی در محیط کشت سلول ترانسفکت شده علاوه بر افزایش بیان پروتئین می تواند سبب کاهش تولید متابولیت های نامطلوب نیز شود.
واژه های کلیدی: سلول CHO , t-PA , فیبرینولیز ,فیبرینوژن
مقدمه
1-1)اهمیت پروئینهای نوترکیب – جایگاه جهانی و درمانی
پروتئین ها ماکرومولکولهایی هستند که در هرجایی از سلولها جای می گیرند.آنها در رشد سلولی، متابولیسم، سازماندهی، انتقال و جهش نقش دارند. در ارگانیسم های چندسلولی، پروتئین ها سیستم ایمنی، سیگنال بندی عصب، رشد و تقسیم کل ارگانیسم را کنترل می کنند.جهش یا رونویسی غیرعادی پروتئین ها می تواند منشاء بیماریهای بسیاری شود. با توجه به اینکه ژنوم انسان حاوی بیش از 30.000 ژن است و اینکه تعداد پروتئین هایی که تولید می شوند حتی بیشتر از این مقدار هستند،فرصت هایی برای شرکت های داروسازی به دست آمده تا داروهای جدیدی را توسعه دهند که بسیار فراوان هستند. بنابراین در طول دهه های گذشته،پروتئین ها به اهدافی برای توسعه درمانهای جدید تبدیل شدند. وقتی که پروتئین ها اولین بار به عنوان موارد درمانی مورد استفاده قرار گرفتند، از منابع انسانی و حیوانی خالص سازی شدند. نمونه هایی از این قبیل شامل هورمون رشد انسان از جسد انسان، انسولین از گاو یا خوک و هورمون تحریک کننده غدد ترشحی انسان از اوره می شدند. به هر حال استفاده از این منابع با نگرانی هایی هم همراه بود.خوشبختانه امروزه محصولات منابع حیوانی کمتر به کار می روند. در واقع از اواخر دهه 1970، رشد در بیوتکنولوژی امکان تولید پروتئین از “DNA دارای صفات ارثی” با استفاده از سیستم های میزبان پروکاریوتی یا یوکاریوتی را فراهم کرده است.این پروتئین ها ، دارای صفات ارثی هستند و از پروتئین های داخلی قابل تمایز هستند، آنها بواسطه رونویسی ژنهایی که دارای صفات ارثی جدید هستند، تولید می شوند. اولین پروتئین نوترکیب، که برای انسان به کار رفت انسولین بود که در E.coli توسط Eli Lili در سال 1984 تولید شد. اولین پروتئین نوترکیب تولید شده در میزبان یوکاریوتی ، فعال کننده پلاسمینوژن بافتی t-PA از سلولهای تخمدان هامستر چینی CHO2 بود که در سال 1986 تولید شد. در سال 2007، بیش از 170 محصول بیودارویی وجود داشت که توسط انجمن دارو و غذا FDA در ایالات متحده تائید شد، اما انتظار می رفت که در سالهای آتی این مقدار افزایش یابد، در سال 2006، حدود 5.000 محصول پروتئینی در آزمایشات اکتشافی و بالینی و پیش بالینی گزارش شد.در میان سیستم های رونویسی کننده میزبان، آنچه که بسیار کاربرد داشت سلولهای کشت شده پستانداران و E.coli بود. حدود نیمی از محصولات پروتئینی درمانی در بازار از سلولهای پستانداران تولید می شد. حتی اگر بافت سلول پستانداران پیچیده و پرهزینه تری نسبت به کشت میکروبی بود باز این سلولها ارجحیت داشتند زیرا سلولهای پستانداران قادر به اصلاح پروتئین ها بعد از PTM (Post Translational Modification) ، و بخصوص گلیکوزیلاسیون بودند.میزبانهای دیگر قادر گلیکوزیلدار کردن پروتئین ها بودند مثل مخمر و سلولهای گیاهان و حشرات کشت شده. این فرایند در این میزبان ها نسبت به آنچه که در سلولهای پستانداران دیده شد، متفاوت بود.اما تلاشها همچنان ادامه داشت تا گلیکوزیلاسیون در این میزبانهای غیر پستاندار هم به شکل پستانداران هدایت شود. در سال 2007، FDA اولین بیودارویی که در سلولهای حشرات برای کاربریهای انسانی تولید شده بود، تائید کرد.میزبانهای جایگزین شامل حیوانات و گیاهان ترنس ژنیک می شدند اما اینها هنوز در مرحله توسعه قرار داشتند.
در سال 1973 Staley Cohenو Herbert Boyer به عنوان پیشگام در استفاده از تکنولوژی DNA نوترکیب برای کلونینگ و بیان ژن خارجی در موجودات شناخته شدند.
تولید اولین پروتئین نوترکیب انسانی چند سال بعد از، زمانی که شرکت زیست فناوری Genetchبیان ژن سوماتوستاتین انسانی را در E. coli را اعلام کرد گزارش شد. میزان فعالیت هورمون به دست امده معادل استخراج سوماتوستاتین از مغز 500.000 راس گوسفند بود. به دنبال این موفقیت در سال 1982 Genetch با humulin ، که انسولین نوترکیب به دست امده از E.coli بود را به عنوان اولین نوترکیب داروی زیست فناوری پذیرفته شده توسط غذا و داروی آمریکا (FDA) را به بازار عرضه کرد.
آنها DNA پلاسمید RSF1010 استرپتومایسین مقاومت از سالمونلا تیفی موریوم را به پلاسمید به pSC101 اشرشیاکلی را کلون نمودند و وجود مقاومت به استرپتومایسین در سلولهای ترانسفورم شده را مشاهده کردند.
ساخت پروتئین نوترکیب یک مرحله چالش برانگیز درفرآیند کشف و تولید دارو می باشد.