دانلود پایان نامه با موضوع ارزیابی اولیه و تولیدکنندگان


Widget not in any sidebars

1-24-1)سیستم بیان پایدار ژن Transient Gene Expression))
هدف اصلی در تولید پروتئینهای نوترکیب در سلولهای پستانداران،ایجاد رده سلولی پایدار (Stable) واجد ژن مورد نظر، در ژنوم سلول همراه با بیان پایداری از پروتئین در بازه زمانی خاص می باشد. که این امر مستلزم مراحل هزینه بر و طولانی جداسازی و تعیین ویژگی رده های سلولی Stable ، ازدیاد رده سلولی مورد نظر با بیان بالا از میان مجموعه ای از سلولهای ترانسفکت شده است،
در موارد زیادی ممکن است که کاندیدهای پروتئینی زیادی یا مشتقات زیادی از یک کاندید پروتئین درمانی ،مورد ارزیابی اولیه درمانی قرار بگیرند. همچنین برای برخی پروتئین ها مقادیر نسبتاً کم برای رفع نیاز، کافی می باشد. استفاده از این روش در پزشکی شخصی نگر Individualized ؛ نیز جایگاه ویژه دارد[25,26].
1-24-2)سیستم بیان موقت ژن Transient gene expression))
امروزه کلیه پروتئینهای نوترکیب موجود در بازار که در سلولهای پستانداران تولید می شوند، حاصل رده های سلولی پایدار هستند که ژن نوترکیب وارد ژنوم میزبان گردیده است. پلاسمید حاوی ژن به صورت پایدار و در کروموزوم ژن میزبان وارد شده است Stable Gene Expression (SGE). روش جایگزین برای آن تکنیک روش Transient Gene Expression (TGE)، می باشد که روش سریع و اسان برای تولید مقادیر مناسب پروتئینهای نوترکیب در سلولهای پستانداران محسوب می گردد. در این تکنیک بیان پروتئین مورد نظر توسط پلاسمید حاوی ژن ترانسفکت شده که بصورت خارج کروموزومی باقی می ماند صورت می پذیرد.
بیان موقت پروتئین(TGE (Transient Gene Expression جهت تولید سریع در میزانهای میلی گرم تا گرم از پروتئین مورد نظر ) در مقیاس بالا روش مناسبی می باشد. دو فاکتور اساسی دخیل در این سیستم پروسه کشت سلولی و روش انتقال ژن می باشد.
بیان ژن موقت در سلولهای HEK به دلیل توانایی آن برای ارائه قابل توجهی مقدار پروتئین در مدت زمان معقول توجه شمار زیادی از تولیدکنندگان را به خود جلب نموده است.
از آنجا که سلولهای CHO و HEK در گلیکوزیلاسیون N- ا تفاوت هایی را نشان داده اند ،در طول سال های گذشته TGE در سلول های CHO به عنوان روشی برای تولید پروتئین با ویژگی های مشابه با نوع تولید شده در مقیاس بزرگ برای آزمایش های پیش بالینی و بالینی مورد توجه عمده قرار گرفته است.
بیان ژن گذرا (TGE) یک روش سریع برای تولید پروتئین نوترکیب از میلی گرم به مقدار گرم در سلول های پستانداران معلق ، به خصوص همستر چینی تخمدان (CHO) و کلیه جنین انسان-293 (HEK-293) سلول می باشد.
تا کنون روش TGE برای تولید پروتئین در تستهای بالینی به دلیل نیاز به بیان زیاد پروتئین با کیفیت ثابت استفاده نشده است. علی رغم اینکه با استفاده از روش TGE تا مقدار L100 نیز Scale-Up شده است میزان بیان حجمی (volumetric productivity ) حاصل از این روش برای سلولهای ترانسفکت شده CHO-DG44 بسیار کمتر از مقادیر حاصل از روش (SGE ) Stable Gene Expression می باشد.
جهت بیان موقت پروتئین در مقیاس Pilot-Scale کشت سلولهای پستانداران در حالت تعلیق ضروری می باشد. Orbital Shake روش مناسبی برای کشت سلولها در مقادیر سلولی بالاست. کم هزینه بودن و عدم نیاز به تجهیزات خاص از مزایای این تکنیک است.
نخستین پروتئین نوترکیب از سلولهای پستانداران که به بازار دارویی وارد شد فعال کننده پلاسمینوژن بافتی (Activase, t-PA) از شرکت Genentech در سال 1986 بوده پس از آن تا سال 2004 بطور میانگین هر سال 9-7 پروتئین نوترکیب از U.S.FDA پذیرش می گرفت [25].
در مواردی که مقادیر میلی گرم تا گرم از پروتئین نوترکیب، مورد نیاز است تکنولوژی موفق TGE (Transient Gene Expression )یا بیان موقت ژن است [27].
با استفاده از عوامل انتقال ژن کم هزینه مانند: کلسیم فسفات و پلی اتیلن ایمین (PEI) ، کشت معلق از سلولهای پستانداران در حجمهای 1 میلی لیتر تا 100 لیتر به روش TGE برای بیان پروتئین تا مقادیر mg/L در بازه زمانی 10-5 روز پس از Transfection مورد استفاده قرار گرفته است .
روش TGE نیاز به ورود پایدار ژن به ژنوم ندارد.پس از ورود DNA به هسته مراحل رونویسی و ترجمه شروع شده و چند ساعت پس از انتقال ژن پروتئین مورد نظر قابل ردیابی خواهد بود.
در ابتدا تکنیک TGE برای سلولهای چسبنده بکار گرفته می شد; اما نیاز به تولید بیشتر توسعه TGE در سیستمهای معلق در مقیاس بالا را ضروری نمود. روشهای ترانسفکشن ویروسی و غیر ویروسی زیادی برای سلولهای معلق بهینه سازی شده اند که در این طرح تنها بر روشهای غیر ویروسی تاکید می گردد.
1-25)روش های انتقال ژن به سلول های پستانداران
با استفاده از دو روش ویروسی و غیر ویروسی می توان ژن ها را به سلول های پستانداران انتقال داد.
در میزان بیان در روش نسبتاً کم هزینه TGE و تعیین محدودیتهای روش TGE برای رسیدن به میزان های بالاتر بیان در سلولهای CHO-DG44 و یافتن راه حلهای مناسب برای رفع محدودیتها مورد نظر می باشد.
ایجاد ساختارمناسب بیان موقت TGE)) در سیستم Shaker Incubator به عنوان زیرساخت برای تولید انواع پروتئینهای نوترکیب در مقیاس مناسب جهت ارزیابی های پیش- بالینی ((Pre-clinical در بخش بیوتکنولوژی انستیتو پاستور ایران محسوب می شود.
امروزه نیاز به پروتئینهای نوترکیب در تحقیقات پایه و کاربردهای بالینی رشد روز افزونی از خود نشان می دهد. لازمه بیان پروتئین های نوترکیب،وارد سازی DNA خارجی به سلول میزبان،طی پروسه ترانسفورماسیون (برای سلولهای پروکاریوتی) و ترانسفکشن (برای سلولهای یوکاریوتی)است. با وجود امکان بیان در انواع میزبانها، کشت سلولهای پستانداران غالباً نخستین انتخاب در زمانی است که تاخوردگی و تغییرات پس ترجمه ای مناسب برای فعالیت پروتئین ضروری است. تقریباً 300 آنتی بادی مونوکلونال و 440 پروتئین نوترکیب بین سالهای 1980 تا 2004 وارد فاز مطالعات بالینی گشتند. در حالیکه 130 مونوکلونال آنتی بادی و 140 پروتئین نوترکیب تحت مطالعات انسانی قرار داشتند. در سال 2007، بیشتر از 170 محصول بیودارویی تائید شده از U.S.FDA وجود داشت.
بطور کلی با وجودیکه این دیدگاه، روش استاندارد برای تولید پروتئینهای نوترکیب در مقیاس بازار است، تولید پروتئینهای نوترکیب در سلولهای پستانداران به روش انتقال ژن و بیان موقت نیز امکان تولید مقادیر میلی گرم تا گرم از پروتئین را در بازه زمانی کوتاه ( چند روز تا چند هفته) با مقیاس تا حدود 100 لیتر را ایجاد می کند. بطوریکه در آینده پروتئینهای تولید شده در این سیستم ممکن است قادر به کسب تائیدیه های نظارتی برای ورود به بازار شوند.
1-25-1)روشهای انتقال ژن غیر ویروسی
روش های غیر ویروسی شامل روش های شیمیایی و فیزیکی می باشد
قدرت تغییر در اندازه و تعداد ژن مورد انتقال و نیز نبود مسائل biosafety از مزایای روشهای غیر ویروسی (non-viral ) انتقال ژن به سلولهای پستانداران،نسبت به روشهای ویروسی سلولها, می باشند. بطور کلی روشهای غیر ویروسی به دو دسته مکانیکی ( میکرو اینجکشن و الکترو پوریشن) و غیر مکانیکی (رسوب کلسیم فسفات- DNA ، لیپوفکشن و پلی فکشن) تقسیم بندی می شوند. اساس روشهای غیر مکانیکی ایجاد نانو پارتیکل هایی با شارژ مثبت، در اتصال به DNA با شارژ منفی می باشد. این ذرات قابلیت ورود به سلول را خواهند داشت. روش رسوب همزمان با کلسیم فسفات، DNA را با کلسیم،رسوب می دهد در حالیکه لیپوفکشن و پلی فکشن اتصال بین DNA و به ترتیب لیپوزیوم (Lipoplex)و پلیمرهای کاتیونی (Polyplex) ایجاد می کند.