تحقیق درمورد اکسیداسیون و استاندارد


Widget not in any sidebars
2-10-1 تهیه معرف برادفورد:
معرف برادفورد شامل100میلی گرم پودر کوماسی بریلیانت بلو G-250 ،50 میلی گرم اتانول 96%. 100میلی لیتر اسید فسفریک (w/w)85 درصد می باشد. این سه ماده را با هم مخلوط کرده و به حجم ml 200 میرسانیم. به این ترتیب محلول x5 بهدست میآید که باید در ظرف تیره نگهداری شود. در زمان آزمایش، محلول فوق را 5 بار رقیق میکنیم تا محلول x1 بهدست آید.
برای تهیه محلول استوک mg/ml1 آلبومین سرم گاوی (BSA)، مقدار معینی (1میلی گرم) از این پروتئین را در 1 میلی لیتر آب مقطر حل کرده و در زمان استفاده آن را ده برابر رقیق میکنیم. حال از این غلظت در لوله‏های آزمایش بهترتیب0، 5، 10، 15، 20، 25، 30 و 35 و40و 45 ماکرولیتر BSA میریزیم و با آب مقطر به حجم 50 میرسانیم و به هر کدام ml 5/2 محلول برادفورد x1 با رعایت فاصلهی زمانی 2 دقیقه اضافه می‏کنیم و به مدت 25-30 ثانیه لولهها را ورتکس میکنیم. بعد از 15 دقیقه جذب لولهها در طول موج 595 نانومتر با ر عایت همان مقدار فاصلهی زمانی با اسپکتروفتومتر میخوانیم. به این ترتیب منحنی استاندارد (جذب علیه (mg/ml)BSA)رسم شده و به کمک آن و با استفاده از شیب خط منحنی، غلظت پروتئین کل محاسبه شد.
2-11 سنجش کلروفیل و کاروتنوئید
5/0 گرم برگ تر از هر تکرار توزین شده و توسط نیتروژن مایع در داخل هاون چینی آسیاب شد و به آن 5 میلیلیتر استون 80 درصد (20 آب مقطر: 80 استون) اضافه گردید. مخلوط به دست آمده به مدت 15 دقیقه با دور (rpm)3000 در دمای ۴ درجه سلسیوس سانتریفیوژ گردید. در نهایت عصاره استونی شفاف جدا شده و حجم آن با استون خالص به 5 میلی لیتر (حجم اولیه) رسانده شد. سپس شدت جذب محلول در طول موجهای 470، 646 و 663 با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (CamSpec M501 UV/Visible) در مقابل شاهد قرائت شد. در نهایت برای تعیین مقدار کلروفیل و همچنین کاروتنوئید کل از فرمولهای زیر استفاده شد (Lichtenthaler, 1987).
Chl.a= (12.25 A663–2.79 A646) ×V/W
Ch1.b=(21.50 A646–5.1 A663)×V/W
Chl.T= Chl.a + Chl.b
Car.=(1000 A470 – 1.82 Chl.a – 85.02 Chl.b)/198×V/W
که در روابط بالا V حجم استن به میلی لیتر و W وزن تر برگ بر حسب گرم می‌باشد. غلظت کلروفیل و کاروتنوئید کل برحسب میلی‌گرم بر گرم وزن تر برگ میباشد.
2-12 اندازهگیری مالون دی آلدهید
برای این منظور 5/0 گرم از بافت برگ در هر تکرار با ml5 تری کلرواستیک اسید 5% ساییده شد. عصاره حاصل، به مدت 15 دقیقه، در دمای اتاق و با دور rpm)) 14000 سانتریفیوژ شده و سپس محلول رویی توسط سمپلر جدا شد. پس از آن به حجم مساوی از محلول رویی (سوپرناتانت) TCA20درصد حاوی5/0 درصد TBA افزوده گردید. مخلوط حاصل به مدت 30 دقیقه در حمام آب جوش با دمای 100 درجه سانتیگراد قرار داده و بلافاصله درظرف یخ سرد شد؛ سپس 2000 میکرولیتر از سوپرناتانت به میکرتیوپ منتقل و به مدت 5 دقیقه در دور rpm)) 7500 سانتریفیوژ شد. سپس جذب کمپلکس MDA+TBA در nm 532 قرائت شد. جذب بقیه رنگیزههای غیراختصاصی در nm 600 تعیین شد و از میزان جذب در nm 532 کسر گردید. برای محاسبه غلظتMDA از ضریب خاموشی mM-1cm-1155 استفاده شد و در نهایت مقدار مالون دی آلدهید که محصول واکنش پراکسیداسیون لیپیدهاست، بر اساس نانو مول در گرم وزن تر محاسبه شد.
2-13 استخراج آنتی اکسیدانهای غیرآنزیمی
به منظور استخراج عصاره آنتی اکسیدانهای غیر آنزیمی مثل فنل از متانول 80% استفاده شد. ابتدا برگ توتون را به مدت 24 ساعت در دمای 38 درجه سانتیگراد در آون قرار داده تا نمونهها کاملا خشک شوند. سپس نمونهها را در هاون چینی ریخته و به خوبی کوبیده شد تا کاملا خرد شوند. سپس 5/0 گرم از هر نمونه آسیاب شده وزن شده و به لولههای شیشهای دارای برچسب با ذکر مشخصات انتقال داده شد. سپس به لولهها 5 میلی لیتر متانول 80% اضافه و بهآرامی مخلوط شد. نمونهها 24 ساعت در دمای 25 درجه شیک شدند. بعد از سپری شدن این زمان، عصارهها با استفاده از کاغذ صافی واتمن، صاف شده و عصارههای صاف شده به مدت ده دقیقه در دور (rpm) 1500 سانتریفیوژ شدند. بعد از سانتریفیوژ، محلول رویی با دقت برداشته شده و به لولههای شیشهای با ذکر مشخصات انتقال داده شدند. سپس در یخچال با دمای 4 درجه سانتیگراد برای مراحل بعدی نگهداری شدند.
2-13-1 سنجش آنتی اکسیدانهای غیرآنزیمی
از بین آنتی اکسیدانهای غیر آنزیمی، سنجش غلظت فنل نمونهها با روش رنگسنجی و با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر انجام شد.
2-13-1-1 سنجش فنل تام
سنجش مقدار فنل تام با استفاده از روش Gaoو همکاران انجام شد که نیازمند استفاده از معرف Folin-Ciocalteu و استاندارد گالیک اسید است. برای این منظور 100 میکرولیتر عصاره در داخل لوله شیشهای ریخته شد. سپس 200 میکرولیتر حلال فولین و 2000 میکرولیتر آب مقطر به آن اضافه شد. پس از گذشت 3 دقیقه، 1000 میکرولیتر کربنات سدیم 20% در غیاب نور اضافه شد. در نهایت نمونهها به مدت یک ساعت در تاریکی و در دمای اتاق گذاشته شدند. بلانک نیز به همین ترتیب با 100 میکرولیتر حلال بهجای عصاره آماده شد. بعد از صفر کردن دستگاه اسپکتروفتومتر با بلانک، جذب نمونهها در طول موج 765 نانومتر خوانده شد.
2-13-1-2 رسم منحنی استاندارد گالیک اسید
جهت بهدست آوردن غلظت فنل تام نمونه، از منحنی استاندارد گالیک اسید استفاده شد. غلظتهای مختلف گالیک اسید شامل: 25، 50، 75 و 100 میلی گرم بر لیتر تهیه شد. به این ترتیب که غلظت گالیک اسید 100 میلی گرم بر لیتر را با متانول 50% تهیه کرده و سایر غلظتها مطابق جدول (2-4) آماده شدند.
جدول 2-4
C4
C3
C2